06.UHT工艺和无菌灌装中微生物学的应用

摘要
食品工业中会用到一些有益的微生物来生产特定的食品；但有些微生物对人来说是有害的，可引起疾病或食物中毒，大多数的真菌都会引起食物变质。
无菌技术最关心的微生物是真菌（霉菌和酵母菌）和细菌。本章将对这类微生物进行一般性讨论并简单涉及到产品和包材灭菌等方面。
1. 概要
微生物是指肉眼看不到的那类数目庞大的生物群，通常被分为以下几类：原生动物，藻类，真菌类（霉菌，酵母），细菌和病毒。在无菌加工技术中，原生动物，藻类和病毒都不常见，以下章节将不再讨论。

1.1霉菌
霉菌是微生物中的一个大群，霉菌在环境很恶劣的条件下仍可以生长，它们可以耐受PH=1.5~8，很低的水分活度（aw）, 很低的温度及很少量的养分。但霉菌生长的环境必须有氧气。霉菌有典型的组织结构，人们可以用显微法将其划分到菌属。在缺氧或无氧的环境下（如被浸没的菌种）霉菌的生长会变慢，通常也不会形成孢子。（图1）
菌丝很细（直径只有几微米），但很长。在有氧的条件下，菌丝会生出特定的结构（孢子囊），在那里孢子囊可以形成大量的孢子，过了一段时间后，这些孢子会同时释放到环境中：孢子象爆炸一样释放到环境中！因此，只要在工厂中发现哪怕是很小的霉斑，都应马上铲除。霉菌的孢子不是很耐热或消毒剂。
在一定的条件下，一些霉菌可以形成相对耐热或耐消毒剂的孢子（囊孢子，厚垣孢子），在果汁加工业中，这个问题已存在了很长时间。
在食品工业中，有些霉菌可用来生长奶酪（Camembert奶酪，蓝奶酪及其他类的奶酪），霉菌也是抗生素的重要来源，然而某些种类的霉菌会生成毒素（毒枝菌素），这些毒素会在体内积聚并致癌。
 

1.2 酵母
酵母通常都是椭圆形的细胞，直径在3到6微米，长度为5到10微米，酵母在10~300C，PH较低的环境下生长。一些酵母可以耐受很低的水分活度（aw=0.6), 但它们对养分的需求高于霉菌。很特别的是酵母是出芽繁殖，也就是在母体酵母上先生出一个芽，这个芽不断长大，最终会和母体分开（如图2所示），和芽分离后的母体细胞膜上会留有一个疤痕，这限制了母体的繁殖数量，一个酵母细胞最多可以8~10个子细胞。
在食品工业中，一些酵母被用来发酵酸奶制品（克尔非酸奶酒，或其他）和酿酒。

1.3 细菌
细菌也是微生物中的一个大群，它们分别在自然界中的各个地方，它们对于氧气的需求也不同，有些细菌是厌氧的，在有养的环境下不能生长，有些是耗氧的，在有氧的环境下适合生长，第三种是兼性细菌，需少量的氧气；大多数的细菌在水分活度低于0.9时不再繁殖，对于养分的需求各不相同，区别很大。在自然界中，细菌在分解有机物方面起到至关重要的作用。在食品工业中，细菌可以引起食品变质，但有些细菌可用来生产发酵奶制品及其他食品。
细菌有三种基本的细菌形态：
a) 小球状（球菌）
b) 直杆状
c) 弯杆状
细菌是通过细胞分裂进行繁殖的，如图3所示。
在适宜的条件下，细菌的繁殖速度很快，一个细菌只需10到15分钟就可以变成两个，一百万个细菌繁殖成两百万个细菌所需的时间和前者相等，这个时间被称之为代时。
在实际应用中，我们把细菌分成两组：
a) 不形成芽胞的细菌；常规的化学，物理方法就可以杀灭细菌营养体。
b) 形成芽胞的细菌；这些细菌在环境恶劣的情况下会形成休眠孢子，休眠孢子是很耐热及耐受消毒剂的，在恶劣的条件下，休眠孢子仍能存活下来。
通过革兰氏染色实验，我们可以将细菌划分为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌。（革兰氏是二十世纪初丹麦物理学家，他曾试图将人体组织中的细菌进行染色）。细菌细胞壁结构的不同，使细菌在染色中有不同的表现，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由蛋白组成，而革兰氏阴性细胞的细胞壁主要由脂类组成，总体来说，革兰氏阳性细菌比革兰氏阴性细菌更难杀死。

1.4 超高温处理和无菌灌装
在超高温处理和无菌灌装过程中， 必须包括如图4所示的几个灭菌环节。
这些灭菌环节的目的是要达到：商业无菌的产品，设备及任何与产品接触的备件的充分灭菌。为此，可以使用物理的方法（热处理，辐射等方式）或化学的方法：其目的是杀灭所有在产品中可以繁殖进而使产品变质的微生物，对于高酸产品而言，只要杀死酵母，霉菌和一些细菌的营养体就可以达到商业无菌，对于低酸产品灭菌不仅要杀灭酵母，霉菌，细菌营养体，还要杀灭芽胞杆菌和梭状芽胞杆菌；芽胞对温度和化学灭菌处理有很强的耐受性，芽胞是细菌的一种休眠状态，不能繁殖；芽胞在极恶劣的条件下也可以存活很长时间，休眠程度越深，芽胞对恶劣环境的抵抗能力越强（图5）；

如果外界环境好转，芽胞开始发芽，芽胞从休眠状态的芽胞变成新的细菌营养体（图5），这时它可以繁殖。

芽胞发芽的第一步是吸收水分，这时的芽胞对温度比较敏感，普通的超高温处理可以很容易地将其杀灭。
超高温灭菌工艺对耐热芽胞有一定的灭菌效率（灭菌效率取决于灭菌工艺和芽胞的耐热程度），灭菌后残留取决于以下几个因素：
• 灭菌工艺参数；
• 芽胞数量，
• 芽胞种类和耐热程度
对于超高温灭菌工艺，应注意以下参数：
• 灭菌时间
• 灭菌温度
因此，整条生产线的无菌生产效率只有在确定了必要的工艺参数后才能给出，而这些参数不是设备工艺商都能控制的，尽管如此，设备供应商可以给出灌装机的无菌效率，通常为1：10，000。
2. 产品灭菌
化学反应的Q10 值约为2~3，对芽胞的杀灭，Q10 值会比较高，通常在8--30：就是说，升高温度，微生物的杀灭效率远比高温灭菌造成的化学变化要高的多，这样，在相同的灭菌效率下，灭菌温度越高，灭菌所需的时间越短，产品的化学变化也越小。
对于一台给定的超高温设备，灭菌效果取决于工艺参数（灭菌时间/温度），芽胞的种类和休眠深度和产品特征，如PH值，水分活度aw , 产品黏度等；对于给定的产品，可以使用以下公式：

灭菌残留=工艺参数+微生物负荷

细菌负荷（芽胞数）由以下因素决定：
a) 原料的质量；
b) 在预处理过程中，原料被污染，微生物繁殖或形成芽胞的程度。
原料是指产品配方中添加的组份，以及在制造过程中需要的材料，如包材；灭菌效率可以通过提高超高温灭菌温度/时间来提高，

因为产品的结垢现象也同时加剧，连续生产时间会缩短，产品的化学变化会相应增加（如产品
变色，营养素的损失等）。我们应有这样的概念：包材灭菌效率的增加通常都会带来得不偿失的副作用。
原奶中嗜温菌芽胞的含量（在英国）随季节变化而变化，冬天比夏天高，芽胞数量在0~700CFU/100毫升，不同种类微生物的比例如下：地衣芽胞杆菌：62%；短芽胞杆菌：15%；枯草芽胞杆菌：7%；其他：9%。
3.包材的灭菌
无菌包装没有明确的定义，所以任何一家公司都可以将其带有包材灭菌系统的灌装机称为无菌灌装机，但无菌效果怎么样却是另外一个问题。
超高温灭菌或化学灭菌对常规微生物和特定的细菌芽胞的灭菌曲线通常是（但不总是）半对数曲线。化学灭菌的效果和超高温一样，也是取决于灭菌参数及微生物（细菌芽胞）的数量，种类和耐受性，如下公式：

灭菌残留=工艺参数+微生物负荷

不同芽胞和梭菌经双氧水灭菌后的残留量可以绘制出一组致死曲线，有一部分极耐热芽胞致死曲线的尾部有上翘的现象，有一种解释认为，这是因为大量的死亡微生物形成菌团，保护了核心的微生物造成的这种现象。A型枯草芽胞杆菌，SA22枯草芽胞杆菌和（globigii）枯草芽胞杆菌对双氧水灭菌都有很强的耐受性，所以我们通常都选用这些微生物来进行灭菌效果实验。对240C，浓度为25.8%的双氧水的耐受性，这些微生物的比较如下：SA22枯草芽胞杆菌>枯草芽胞杆菌(globigii)>凝结芽胞杆菌>嗜热脂肪芽胞杆菌>梭状芽胞杆菌>金黄色葡萄球菌，它们的D值分别是7.3, 2.0, 1.8, 1.5, 0.8 和0.2分钟。芽胞的菌龄不影响其耐受性，但干燥的芽胞却是湿芽胞耐受性的两倍（166，167）。对于一个特定的灭菌过程而言，其灭菌效率可以用细菌芽胞在灭菌过程中数量级的递减数量来表示。
我们发现枯草芽胞杆菌的芽胞经240C，浓度为15-35%的双氧水处理后可以被激活， 90%以上的芽胞在经800C，5分钟的热处理后都可以被激活，但是，当温度上升到1000C，会造成芽胞的永久失活，这一温度是大多数包材灭菌过程中达到的温度。
大多数的无菌包装系统中，包材（产品接触面）的灭菌常常用双氧水进行化学灭菌，以下参数因予以考虑：

• 用什么样的化学灭菌剂
• 灭菌剂的浓度
• 灭菌剂和被灭菌物体间的接触
• 接触的时间
• 接触的温度
如前所属，喷雾法不能将所有的食品接触面上附着上灭菌剂，根据喷嘴结构的不同，通常只有30-40%的包材食品接触面上附着上双氧水，但是接下来的干燥处理，即用1800C的无菌热空气对包材进行加热，以去除包材上的双氧水，使其在产品中的残留达到可接受的水平， 这一热处理过程使双氧水蒸发，弥补了喷雾时双氧水与包材接触不充分的不足，使灭菌效率大大提高，达到了满意的灭菌效果。
要到达最佳的灭菌效果，建议使用50%浓度的双氧水。双氧水温度在800C以上时，最具耐受性的芽胞杆菌的芽胞也会被迅速杀灭，霉菌的孢子，细菌营养体和酵母菌细胞的耐受性没有那么强，在很低的温度下就可以被双氧水杀灭。枯草芽胞杆菌的芽胞的D值在双氧水浓度和温度升高是迅速减小，参见表3。
 

表4列出了一个早期的研究结果，可以看出结论是相似的。
在不同的温度和浓度下，Q10值的变化不大，范围在1.36~1.74之间。

肉毒梭状芽胞杆菌在35%的双氧水环境下比枯草芽胞杆菌更易被杀灭，参见表5。
 

 用双氧水做为灭菌剂，我们可以得到如表6所示的D值和Z值。

按照美国食品药品管理局的相关要求，对包材的灭菌效率为：对枯草芽杆菌的芽胞的灭菌效率不得低于4D。
低浓度双氧水在结合紫外线照射的情况下灭菌效率可以大大地提高，紫外线对芽胞的灭菌效率在有双氧水的情况下是单独用紫外线灭菌效率的2000倍。紫外线照射结合2.5%的双氧水，然后再进行850C加热，这种灭菌方法在实验中对实验所用的15种芽胞杆菌和梭状芽胞杆菌的灭菌效率均可以到达99.99%(4D)。将灭菌剂喷到塑料表面进行包材灭菌的灌注系统很少宣称紫外灯和双氧水的结合效率，这是因为双氧水在包材表面仅仅是部分覆盖。